一种大视野超分辨结构光照明显微成像方法

摘要Abstract近年来结构光照明显微术(SIM)在技术发展和应用方面都受到了广泛关注。 然而,传统采用空间光调制器(SLM)进行条纹投影的SIM成像视野有限。为满足生物医学研究中高通量显微成像的需求,本文基于SIM开发一种基于激光干涉的大视野超分辨荧光显微成像统,该方法包含了条纹投影的二维光栅和选择条纹方向及执行精确相移的SLM。与传统的SIM相比, 所提出的方法突破了数字化投影设备对条纹数量的限制,具备高速高精度相移的优势。并通过实验验证该方法的有效性。1理论分析Theoretical analysis1.1 光路设计本文方法光路设计如图1所示,在相机端口可直接观测到样本,最后通过重构计算得到超分图像。该光路所用空间光调制器（SLM）为UPOLabs空间光调制器HDSLM80R。图 1 本文大视野 SIM 方法示意图1.2 激光干涉验证首先,通过SLM和针孔滤波验证来生成一维条纹的可行性。如图1所示,SLM上的相位遮极被分成4个象限,±1级沿+45°方向覆盖,±1级通过遮极孔能够进一步被滤波,如图2所示,图2(b)和(c)为遮极面的光谱强度分布,可以通过相机测量光栅加载到SLM前后的光强分布。在光栅加载象限相位遮极之前,正交方向上的±1级可通过4个针孔并生成二维晶格图案(如图2(b)所示)将二元光栅加载到SLM的第二象限和第四象限后,沿-45°方向的+1级将被光栅衍射。除了零级外所有的衍射级将被针孔阻挡,如图2(e)所示,其余衍射级次的强度可忽略,因其只占总强度的4.5%。图2(f)为一个方向的条纹,传统SIM解决方案采用SLM/DMD能够实现500以内条纹投影,主要是因为SLM/DMD只包含了有限像素(采用1个周期4个像素的方式进行相移)。而本文方法仅需要一个二维的光栅和SLM,即可生成1760个条纹,数量是传统SIM的3倍且具有更快旋转和相移速度。图 2 SLM 上加载光栅前后的光强分布1.3 SIM空域重建算法SIM系统成像需要采集不同方向和不同相位的多幅结构光照明的原始图像进行重构。一般通过三步相移结构光对物体分别进行照明,3个角度加3个相位共获得9幅低分辨率图像,然后将低分辨率图像经过傅里叶变换、频谱分离、频谱移动以及频谱拼接等多个步骤得到了高分辨率图像,繁琐的频域处理过程十分费时。课题组开发一种在空域快速重建超分辨图像的方法。空域中同样对频谱分量进行分离,但是分离的结果不再是样品频谱的左右平移,而是针对系统的点扩散函数进行平移针对空域算法而言,结构光条纹方向的改变直接作用在了OTF上面,也就是说通过OTF左右的平移及拼接合成得到超分辨率系统的等效OTF结果。通过公式可求得超分辨图像,结合GPU并行计算技术,可进一步加速空域超分算法,提高成像速度。2实验验证Experimental validation首先利用SLM验证本文方法的相移效果,当相位模式用灰度值0,48,96,144和192编码在SLM的第一象限时,将获得45°方向上0.2-/5,4-/5,6-/5和8-/5对应的条纹图。将这些相位加载到SLM上,如图1(b)所示可以在-45°方向上得到相同的相移。在没有荧光滤光片的情况下,在样本平面放置一个平面反射镜来记录强度模式,图3(a)展示了产生的条纹相移图案,图3(b)展示了5个相位沿同轴方向的强度分布。图 3 五步相移示意图为了验证本文方法大视野、超分辨显微成像的有效性,试制了图4所示的大视野SIM系统原理样机。实验验证了该方法的有效性,在20×物镜NA0.75的条件下,在分辨率提升到1.8倍的同时成像视野可达1380μm×1035μm,具备3倍于传统SIM的吞吐量。图 4 大视野 SIM 样机的光路超分图像与直接宽场成像(原图)相比分辨率和对比度明显提升,如图5所示,圈选了成像视野中5个图像子区进行对比观察,放大3倍后微丝结构清晰可见(海拉细胞样本)。图 5 海拉细胞的超分成像最后,对比了频域超分重建算法和空域超分重建算法的计算速度。采用三步相移结构光对样本分别进行照明,3个角度加3个相位共获得9幅低分辨率图像,即每幅超分图像共需要获取9 幅图像。每种图像分辨率下,计算时间取100次重建计算的均值,统计结果如表1所示。随着图像分辨率的增加,计算耗时明显增加,通过分析验证了所述空域超分重建算法与传统频域超分重建算法相比可大幅降低计算耗时, 超分辨成像速度提高约10倍。在此基础上,结合GPU并行加速技术可进一步将速度提升15倍左右。论文信息：胡 浩,郜 鹏.一种大视野超分辨结构光照明显微成像方法[J].仪器仪表学报,2023,44(5):177-183.DOI: 10. 19650 / j. cnki. cjsi. J2311050* 该技术分享所涉及文字及图片源于发表论文和网络公开素材,不做任何商业用途。